Tutoriel
Effectuer une purification réussie de l'ADN en utilisant le phénol/chloroforme et acquérir une compréhension approfondie du mécanisme opératoire de cette méthode d'extraction.
Acquérir une connaissance précise des substances avec lesquelles vous travaillez est crucial. De nombreux réactifs impliqués dans cette méthode présentent des risques potentiels, et il est impératif de consulter les fiches de données de sécurité avant toute manipulation de ces produits.
Il est primordial de noter que le phénol a la capacité d'être absorbé rapidement par la peau, pouvant entraîner des brûlures sévères pour la peau et les yeux, voire endommager vos vêtements. Cette réaction est encore plus accentuée lorsque le phénol est associé au chloroforme. En parlant du chloroforme, il est important de souligner qu'il a des propriétés irritantes pour la peau et les yeux, et des suspicions de cancérogénicité et de toxicité pour la reproduction chez l'homme.
Dans ce contexte, il est recommandé de mettre en place des procédures spécifiques pour minimiser les risques :
La sécurité est la priorité, et ces mesures garantissent une manipulation responsable de ces produits chimiques potentiellement dangereux.
Réactif : Glycogène (20 μg/μL) Objectif : Le glycogène joue le rôle de support, facilitant la précipitation de l'ADN et contribuant à la visualisation du dépôt d'ADN.
Réactif : NH4OAc 7,5 M (acétate d'ammonium) Objectif : L'acétate d'ammonium (ou un autre sel similaire) agit en conjonction avec l'éthanol pour provoquer la précipitation de l'ADN, laissant les glucides et les dNTP en solution.
Réactif : Mélange Phénol:Chloroforme:Alcool isoamylique (PCI) (25:24:1) Vous pouvez soit préparer la solution vous-même, soit acquérir une solution prête à l'emploi. Objectif : La solution PCI engendre la formation de deux phases liquides distinctes : une phase aqueuse contenant l'ADN et une phase phénolique contenant les protéines. Du fait de sa densité supérieure à celle de l'eau, la phase aqueuse contenant l'ADN se positionne au-dessus de la phase phénolique après centrifugation.
Réactif : Alcool Éthylique à 100% (EtOH) Objectif : L'éthanol (ou éventuellement l'isopropanol) est utilisé pour précipiter et concentrer l'ADN. La précipitation des acides nucléiques à l'aide d'alcool repose sur le principe de la séparation en présence de sels (comme l'acétate d'ammonium), ce qui a pour effet de rendre les acides nucléiques insolubles.
Réactif : Alcool Éthylique à 70% Objectif : Une solution d'EtOH de 70 à 80% est employée pour le rinçage du précipité d'ADN avant la phase de séchage et de réhydratation.
Ajoutez un volume de mélange phénol:chloroforme:alcool isoamylique (25:24:1) à votre échantillon (Tube 1) dans des proportions égales, puis effectuez une agitation vigoureuse pendant 1 minute à l'aide d'un vortex.
Effectuez une centrifugation à 16 000 × g à température ambiante pendant 5 minutes. Transférez avec précaution la phase aqueuse supérieure contenant l'ADN dans un nouveau tube de microcentrifugeuse de 1,5 ml (Tube 2), en évitant tout transfert de la phase phénolique inférieure pendant le pipetage.
Vous pouvez alors procéder à la précipitation à l'éthanol, ou vous avez la possibilité d'opter pour les étapes facultatives ci-dessous afin d'optimiser le rendement de l'ADN :
Ajoutez des volumes égaux de solution de chloroforme/alcool isoamylique (24:1) (par exemple, Ready-Red™) au Tube 2, puis agitez pendant 1 minute à l'aide du vortex.
Effectuez une nouvelle centrifugation du Tube 2 à 16 000 × g à température ambiante pendant 5 minutes.
Transférez la partie supérieure de la solution aqueuse dans un nouveau tube (Tube 3), en veillant à ne pas transférer de phase de chloroforme/alcool isoamylique.
Procédez ensuite à la précipitation à l'éthanol comme suit : [instructions pour la précipitation à l'éthanol].
Cette méthode vous permettra d'extraire l'ADN en utilisant le phénol chloroforme tout en optimisant la pureté et le rendement. Veillez à suivre chaque étape avec minutie et à maintenir des conditions de sécurité appropriées lors de la manipulation des réactifs et des échantillons.
Ajoutez les réactifs suivants à la phase aqueuse en suivant l'ordre indiqué ci-dessous :
Incubez le tube à une température de -20°C pendant une nuit, afin de permettre la précipitation de l'ADN. En alternative, une incubation dans de la neige carbonique ou à -80°C pendant au moins 1 heure est envisageable.
Réalisez une centrifugation de l'échantillon à 4 °C durant 20 à 30 minutes à une force de 16 000 × g, permettant ainsi la sédimentation de l'ADN. Extrayez délicatement le surnageant tout en préservant le dépôt.
Nettoyez le dépôt en ajoutant entre 150 μL et 300 μL d'éthanol à 70%. Centrifugez l'échantillon à 4°C pendant 2 minutes à une force de 16 000 × g. Retirez soigneusement le surnageant.
Réitérez l'étape 3 et éliminez toute trace d'éthanol restant. En option, une nouvelle étape de lavage (étape 4) peut être réalisée, suivie d'une centrifugation similaire à l'étape 3.
Procédez au séchage à l'air du dépôt d'ADN à température ambiante pendant une durée de 5 à 10 minutes.
Réhydratez le dépôt d'ADN séché dans une solution de Tris-HCl 10 mM, à pH 8,5, en utilisant des mouvements de pipetage de haut en bas.
