Comment Créer et mettre en œuvre des écouvillons d'extraction d'ADN standards

Les solutions de CTAB sont fréquemment employées pour extraire et purifier l'ADN à partir de tissus végétaux, car elles facilitent la séparation des polysaccharides. L'introduction de polyvinylpyrrolidone (PVP) peut également contribuer à l'élimination des polyphénols indésirables.

Ingrédients et instructions :

• Solution d'Extraction à base de CTAB (pH 8)
  • Tris-Cl à une concentration de 100 mM, pH 8,0
  • EDTA à une concentration de 20 mM, pH 8,0
  • NaCl à une concentration de 1,4 M
  • CTAB (bromure de cétyltriméthylammonium) à une concentration de 2 % (p/v)
  • PVP (polyvinylpyrrolidone) 40 000 à une concentration de 1 %
  • 2-β-mercaptoéthanol à une concentration de 0,3 % (ajouté directement avant utilisation en utilisant une hotte de sécurité)
• Mélange de chloroforme et d'alcool isoamylique (24:1 v/v)
• NaCl à une concentration de 6 M
• Acétate de potassium à une concentration de 3 M
• Glace pour maintenir l'alcool isopropylique à 100 % en état de refroidissement
• Alcool éthylique à 70 %
• Réhydratation dans une solution tampon TE 1 × (Tris-HCl à 10 mM, pH 8,0 ; EDTA à 1 mM, pH 8,0, préalablement autoclavée)

Une technique établie pour isoler l'ADN plasmidique d'E. coli consiste en une lyse alcaline. Les bactéries renfermant le plasmide sont décomposées au moyen d'une solution SDS/NaOH. L'addition d'acétate de potassium concentré induit la coagulation des protéines et de l'ADN chromosomique, laissant l'ADN plasmidique en solution. Celui-ci peut ensuite être extrait grâce à une colonne de silice.

Ingrédients et Instructions

• Solution de Remise en Suspension
  • Tris HCl à 50 mM, pH 8
  • EDTA à 10 mM
  • RNase A à une concentration de 100 µg/ml
• Solution de Lyse
  • NaOH à une concentration de 0,2 N
  • 1 % de FDS
• Acétate de potassium à une concentration de 3/5 M, pH 6 (utilisé comme tampon de neutralisation)
• Isopropanol
• Éthanol à 70 %
• Réhydratation/Élution : utiliser de l'eau ou un tampon TE.

Les échantillons possédant une composition bactérienne variée ou inconnue, tels que dans le contexte de la métagénomique, présentent une complexité accrue. Pour en savoir davantage sur les défis liés à la métagénomique et les approches pour les surmonter, n'hésitez pas à vous informer sur ces sujets.

Le tampon de lyse pour les cellules de mammifères est fréquemment employé afin de préparer les cellules avant leur passage sur une colonne de centrifugation commerciale, destinée à isoler l'ADN. Le tampon exempt de RNase peut être préalablement mélangé et conservé à température ambiante.

Ingrédients et directives :

Tampon de Lyse d'ADN

• EDTA à une concentration de 0,1 M (pH 8,0)
• 0,5 % (p/v) de FDS
• Tris-Cl à une concentration de 10 mM (pH 8,0)
• 20 μg/ml de RNase pancréatique sans DNase (à ajouter juste avant l'utilisation)

L'extraction de l'ADN à partir de sang humain, qu'il soit frais ou congelé, est un processus essentiel.

Ingrédients et Instructions

• Tampon de Lyse pour les Globules Rouges (pH 7,6) :
  • NH4Cl à une concentration de 0,155 mol/L
  • KHCO3 à une concentration de 10 mmol/L
  • EDTA (Na2) à une concentration de 0,1 mol/L
  • Ajouter 20 μg/ml de RNase pancréatique sans DNase juste avant l'utilisation
• Tampon d'Extraction à base de CTAB (pH 8,0) :
  • Tris à une concentration de 1,5 mol/L, pH 7,6
  • Sel disodique d'acide éthylènediaminetétra acétique (Na2 EDTA) à une concentration de 0,4 mol/L
  • NaCl à une concentration de 2,5 mol/L
  • 2 % de bromure de cétyl triméthyl ammonium (CTAB)
• 10 % de SDS (dodécylsulfate de sodium)
• β-mercaptoéthanol
• Mélange de chloroforme et d'alcool isoamylique (24:1)
• Isopropanol
• Éthanol à 70 % et 90 %

Ces étapes permettent d'extraire l'ADN de l'échantillon de sang de manière efficace.

Les méthodes d'extraction d'ADN adaptées aux cellules somatiques humaines montrent leur inefficacité face aux spermatozoïdes, en raison du degré élevé de compactage nucléaire et de la stabilité de l'ADN au sein de ces cellules reproductrices.

Ingrédients et Directives

• Tampon de Lyse (10x) - 50 mL
  • 5 ml de Tris-HCl 1 M
  • 1 ml de NaCl 5M
  • 2,5 ml de MgCl2 1 M
  • 41,5 ml d'eau
• 500 µL de solution ARN-Plus
• 50 µL de protéinase K
• 500 µL de chloroforme
• Ajouter ensuite 800 µL d'éthanol pur refroidi et 40 µL de citrate de sodium 3 M également froid
• Enfin, utiliser de l'éthanol à 70 %
• Réhydratation : utiliser soit une solution de Tris-HCl, soit de l'eau distillée.

Ces étapes sont conçues pour dissoudre les spermatozoïdes et extraire l'ADN de manière appropriée.

Quantifier le contenu et la qualité de l'ADN en utilisant un spectrophotomètre tel que le NanoDrop, en mesurant les absorbances à 260 nm, 280 nm et 230 nm. En fonction de la concentration, vous pourriez devoir diluer un échantillon afin d'obtenir une lecture précise.