Comment Préparer des échantillons marins pour le séquençage de l'ADN environnemental

Avant de commencer la collecte et l'extraction, il est important de prendre en compte que certains échantillons peuvent nécessiter un traitement spécifique en fonction de leur type et des objectifs du projet. Par exemple, les sédiments marins peuvent contenir des débris volumineux et peuvent nécessiter un processus de filtrage et de lavage à travers un tamis à mailles, un filtre à café ou une gaze afin d'éviter les problèmes tout au long du processus de collecte et d'extraction.

Selon le type d'échantillon et les éléments que vous souhaitez évaluer, il peut être nécessaire d'homogénéiser votre échantillon afin de capturer pleinement l'ADN environnemental présent. Les systèmes de battement de billes, tels que les instruments FastPrep de MP Bio et la matrice de lyse E de MP Bio, sont efficaces pour la lyse mécanique et l'homogénéisation, et sont largement utilisés pour préparer des échantillons environnementaux en vue de l'isolement de l'ADN à partir de divers types d'échantillons, y compris des échantillons aquatiques et des sédiments marins.

Il existe trois principales méthodes couramment utilisées pour collecter l'ADN environnemental à partir d'échantillons d'eau : la filtration, la précipitation et l'ultrafiltration centrifuge.

Filtration : La filtration est la méthode la plus répandue, car elle permet de traiter de grands volumes d'échantillons pour obtenir des rendements élevés en ADN environnemental. La taille des pores et le matériau du filtre jouent un rôle crucial dans la collecte de l'ADN en fonction du type d'échantillon. Les filtres avec des tailles de pores de 1 à 10 μm capturent efficacement la plupart des ADN provenant de macro-organismes, tandis que les ADN provenant de micro-organismes peuvent nécessiter des tailles de pores inférieures à 1 μm. Les échantillons présentant une forte turbidité et de gros débris peuvent obstruer facilement les filtres, il peut donc être nécessaire d'effectuer une préfiltration.

Voici quelques exemples de matériaux de filtres couramment utilisés avec leurs tailles de pores :

• Nitrate de cellulose : 0,45 μm
• Microfibre de verre GF/F : 0,7 μm
• Microfibre de verre : 1,2 μm

Dans la plupart des cas, la collecte de l'ADN sur des filtres en nitrate de cellulose avec une taille de pore appropriée, suivie du stockage des filtres dans le tampon de Longmire, permet d'obtenir de l'ADN de haute qualité en quantité suffisante. Cependant, il n'existe pas de méthode universelle, il est donc recommandé de tester et d'optimiser les protocoles spécifiques à votre système pour obtenir de manière cohérente l'ADN environnemental dont vous avez besoin. Pour des conseils détaillés sur le traitement des échantillons d'ADN environnemental aquatique, vous pouvez consulter le guide de Kumar, Eble et Gaither.

Précipitation : La précipitation de l'ADN à l'aide d'isopropanol ou d'éthanol est souvent utilisée pour les échantillons d'eau de faible volume (par exemple, 15 ml) et est idéale lorsque la concentration d'ADN de l'espèce d'intérêt est élevée. Cette méthode nécessite moins d'équipement et est donc adaptée aux scientifiques travaillant dans des zones difficiles d'accès ou sans accès à l'électricité.

Ultrafiltration centrifuge : Cette méthode est largement utilisée pour concentrer et purifier l'ADN, et elle élimine le besoin de réactifs supplémentaires lors de la collecte d'ADN à partir d'échantillons d'eau. Elle consiste à récupérer l'ADN volumineux dans le rétentat, tandis que les molécules plus petites et l'ADN linéarisé plus long passent à travers la membrane et se retrouvent dans le filtrat.

L'ultrafiltration centrifuge est idéale pour traiter de nombreux échantillons de petit à modéré volume. Elle peut également être combinée avec les méthodes de filtration décrites précédemment pour les grands volumes d'échantillons. Cela implique la capture de l'ADN environnemental sur le filtre approprié, sa remise en suspension dans de l'eau ultrapure, puis sa collecte par ultrafiltration.

L'extraction et la purification de l'ADN peuvent être réalisées à l'aide d'un kit d'extraction d'ADN commercial ou d'une méthode de séparation en phase liquide, telle que la méthode CTAB. Les kits d'extraction d'ADN commerciaux sont plus largement utilisés, principalement en raison de leur meilleure récupération, efficacité et reproductibilité. Cependant, il existe de nombreux kits disponibles et les performances de chaque kit peuvent varier en fonction de la méthode de collecte d'ADN environnemental et de l'état de l'échantillon, comme la présence d'inhibiteurs.

Dans une étude comparative de différents kits d'extraction d'ADN commerciaux, Eichmiller et al. ont constaté que le kit FastDNA™ SPIN de MP Bio produisait la concentration d'ADN de carpe la plus élevée et était le plus sensible pour la détection de l'ADN. De même, Liu et al. ont démontré que le kit FastDNA™ SPIN pour le sol surpassait quatre autres kits commerciaux dans l'extraction de l'ADN environnemental des communautés de plancton d'un réservoir d'eau douce.

Avant de procéder au séquençage de l'ADN environnemental (ADNe), il est recommandé de mesurer la concentration et la pureté de l'ADNe à l'aide d'un spectrophotomètre. Cette étape permet d'évaluer la qualité de l'ADNe extrait et de déterminer si les échantillons sont appropriés pour le séquençage.

En utilisant un spectrophotomètre, vous pouvez mesurer l'absorbance de l'ADNe à différentes longueurs d'onde pour estimer sa concentration. La concentration d'ADNe est souvent exprimée en termes de concentration d'ADN double brin (dsDNA) en ng/µL. Une concentration suffisante est nécessaire pour assurer une amplification et un séquençage efficaces.

De plus, la pureté de l'ADNe peut être évaluée en analysant le rapport d'absorbance entre les longueurs d'onde spécifiques. Le rapport le plus couramment utilisé est le rapport 260/280 nm, qui indique la présence de contaminants tels que les protéines ou les agents d'extraction. Un ratio proche de 1,8 à 2,0 est généralement considéré comme indiquant une pureté élevée de l'ADNe.

En mesurant la concentration et la pureté de l'ADNe, vous pouvez prendre des décisions éclairées sur les échantillons à utiliser pour le séquençage et optimiser les conditions expérimentales pour obtenir des résultats fiables.

Filtre bouché :

• Pour remédier à un filtre bouché, vous pouvez homogénéiser votre échantillon pour faciliter la filtration ou préfiltrer l'échantillon pour éliminer les gros débris.
• Une autre approche consiste à augmenter le nombre de répliques de filtres utilisés pour la collecte afin de répartir la charge de particules et éviter l'obstruction.

Contamination de l'échantillon :

• Utilisez des porte-filtres jetables pour éviter toute contamination due à un nettoyage insuffisant des porte-filtres réutilisables.
• Pour la collecte et la conservation de l'ADN environnemental, les filtres à capsules Sterivex-GP sont recommandés car ils offrent une protection contre les contaminations croisées.
• Veillez à porter des gants de la collecte d'échantillons à l'extraction d'ADNe pour éviter toute contamination externe.

ADN dégradé :

• Pour minimiser la dégradation de l'ADN, il est préférable d'extraire l'ADN environnemental le plus tôt possible après le prélèvement de l'échantillon, idéalement dans les 24 heures.
• Stockez l'ADN extrait à une température de -20°C pour maintenir sa stabilité jusqu'à ce que vous soyez prêt à effectuer le séquençage ou d'autres analyses ultérieures.
• Si vous homogénéisez votre échantillon avant le prélèvement, vous pouvez envisager d'utiliser une matrice de lyse moins agressive pour préserver l'intégrité de l'ADN.

Manque de reproductibilité :

• L'utilisation d'un système automatisé tel que le MPure-12™ peut minimiser la variabilité du pipetage et garantir une cohérence entre les échantillons.
• En cas de manque de reproductibilité, il est recommandé de dépanner et d'optimiser la méthode de collecte en examinant les différentes étapes et en identifiant les sources potentielles de variation.
• Pour les échantillons à haut débit, l'utilisation de kits tels que le FastPrep-96 pour la préparation des échantillons sol/microbes permet d'obtenir une reproductibilité constante à grande échelle.