Comment Extraire l'ADN du sang

Lorsque vous planifiez l'isolement de l'ADN à partir du sang, il est essentiel de prendre en compte le moment de l'utilisation de l'échantillon et sa méthode de stockage. La qualité de l'ADN génomique isolé dépend largement de la façon dont vous préparez et conservez vos échantillons de départ.

Le plasma du sang total contient des nucléases qui peuvent potentiellement altérer l'ADN. Cependant, tant que les leucocytes restent intacts, ces nucléases n'affecteront pas l'ADN. Par conséquent, la stabilité des leucocytes et de l'ADN qu'ils contiennent est influencée par les méthodes de stockage et de préparation des échantillons. Voici quelques conseils pour maintenir l'intégrité de votre ADN cible :

1. Évitez de conserver les échantillons de sang frais entre 4 et 8 °C pendant plus d'une semaine. À cette température, les leucocytes deviennent de plus en plus instables avec le temps, et l'ADN est exposé aux nucléases, ce qui réduit la taille de l'ADN purifié.

2. Évitez d'utiliser les échantillons de sang le jour même, car ils peuvent être difficiles à lyser, et il peut être compliqué d'obtenir une pureté constante de l'ADN entre les échantillons. Idéalement, conservez les échantillons de sang frais entre 4 et 8 °C pendant 2 à 3 jours avant de commencer le processus de purification.

3. Si vous prévoyez de ne pas utiliser vos échantillons de sang total dans les jours à venir, conservez-les à -80 °C pour obtenir un ADN de haute qualité. Cependant, évitez de décongeler ces échantillons avant la purification.

Pourquoi éviter de décongeler des échantillons de sang total congelés :

Lorsque les échantillons de sang gèlent, des cristaux de glace se forment, endommageant les leucocytes et permettant aux nucléases de dégrader rapidement l'ADN recherché. Afin de protéger l'ADN, conservez les échantillons congelés pendant l'ajout des composants de lyse, puis incubez-les immédiatement à 56 °C pour obtenir de grands fragments d'ADN. En suivant ces conseils, vous améliorerez la qualité et l'intégrité de l'ADN isolé à partir de vos échantillons de sang.

1. Stockez la protéinase K (et la RNase si utilisée) à -20 °C.
2. Refroidissez vos solutions de lyse et PBS en les plaçant sur de la glace.
3. Préparez vos tampons de lavage conformément au protocole.
4. Réglez un bain-marie ou un bloc chauffant à 56 °C pour la lyse de l'échantillon.
5. Préchauffez le volume approprié de tampon(s) d'élution à 60 °C.
6. Si vous traitez plusieurs échantillons, préparez un mélange maître du tampon de lyse, de la protéinase K et de la RNase pour réduire le pipetage. Vous pouvez exclure la RNase A si une faible contamination par l'ARN n'affecte pas vos applications ultérieures.
7. Étiquetez vos tubes pour éviter de mélanger les échantillons.
8. Portez des gants et nettoyez votre banc de travail avec de l'alcool pour prévenir toute contamination et dégradation de l'ADN.

Pour le sang total :

1. Transférez 100 µl de sang total dans un tube de microcentrifugeuse de 1,5 ml (ajoutez du PBS froid pour atteindre un volume total de 100 µl).
2. Ajoutez la protéinase K, la RNase A et le tampon de lyse (ou votre mélange maître préparé) et vortexez immédiatement. Pour le sang congelé, n'effectuez pas de décongélation - ajoutez les enzymes et le tampon de lyse (ou le mélange maître) directement à l'échantillon congelé et procédez immédiatement.
3. Incubez pendant 5 minutes à 56 °C en vortexant de temps en temps.
4. Procédez à la liaison à l'ADN et à l'élution.

Pour le sang total nucléé :

1. Transférez 10 µl de sang total dans un tube de microcentrifugation de 1,5 ml.
2. Ajoutez 90 µl de PBS froid et mélangez au vortex.
3. Ajoutez la protéinase K et la RNase A, puis vortexez immédiatement (n'ajoutez pas le tampon de lyse en même temps).
4. Ajoutez le Lysis Buffer et vortexez (la solution deviendra visqueuse).
5. Incubez pendant 5 minutes à 56 °C en vortexant de temps en temps.
6. Procédez à la liaison à l'ADN et à l'élution.

En option, vous pouvez utiliser des matrices de lyse pour lyser vos échantillons.

Colonnes de centrifugation en silice : Centrifugation en plusieurs étapes

1. Ajoutez un tampon de liaison à votre échantillon lysé et mélangez délicatement au vortex.
2. Appliquez votre échantillon sur la colonne en veillant à ne pas perturber la membrane, à ne pas trop remplir la colonne, ou à ne pas toucher la membrane.
3. Centrifugez l'échantillon (la vitesse et la durée varient selon le kit) pour piéger l'ADN sur la membrane. Transférez la colonne dans un nouveau tube.
4. Appliquez le tampon de lavage et centrifugez à vitesse maximale (>12 000 xg) pendant 1 minute pour éliminer les contaminants à travers la membrane - jetez le flux à travers (répétez selon votre protocole spécifique).
5. Transférez la colonne dans un tube propre sans DNase.
6. Appliquez le tampon d'élution préchauffé (100 µl) sur la membrane, incubez à température ambiante pendant 1 minute, centrifugez à vitesse maximale (>12 000 xg) pendant 1 minute pour libérer l'ADN.
7. Répétez l'étape d'élution en fonction de votre kit spécifique.

Billes magnétiques : Utilisation de porte-billes magnétiques et pipetage

1. Mélangez l'échantillon lysé avec le tampon de liaison.
2. Appliquez les échantillons sur les tubes (ou puits) contenant les billes magnétiques, permettant à l'ADN de se lier.
3. Lavez les billes avec le tampon de lavage, en agitant doucement l'échantillon.
4. Utilisez un support magnétique pour maintenir les billes en place, puis retirez et jetez le tampon de lavage.
5. Répétez les étapes de lavage selon votre protocole spécifique (par exemple, le kit d'extraction d'ADN sanguin MPure a trois tampons de lavage différents).
6. Appliquez votre tampon d'élution sur les billes lavées et agitez les tubes pour libérer l'ADN dans la solution.
7. Placez vos tubes sur le support magnétique et pipetez l'éluant dans un tube frais sans DNase. Répétez l'étape d'élution en fonction de votre kit spécifique.

Après avoir purifié l'ADN, quantifiez-le en utilisant la spectrophotométrie. Vous pouvez utiliser l'ADN purifié immédiatement pour vos analyses ultérieures ou le stocker à -20 °C. Évitez de soumettre l'ADN à des cycles de congélation et de décongélation répétés pour préserver sa qualité.

Pour isoler l'ADN du sang en utilisant les produits de MP Bio, vous avez le choix entre des réactifs économiques et des systèmes automatisés à haut débit. Vous pouvez acheter individuellement les matrices de lyse, les réactifs, les colonnes de centrifugation, les tubes de récupération et d'autres équipements nécessaires, ou opter pour un kit complet comprenant tout ce dont vous avez besoin.

Voici quelques options de kits disponibles :

1. Kit d'ADN de tissus et d'insectes FastDNA-96, 2 x 96 préparations : Ce kit permet une isolation rapide et à haut débit de l'ADN génomique prêt pour la PCR à partir d'échantillons d'animaux et d'insectes, y compris le sang total.

2. Kit d'extraction d'ADN sanguin MPure, 48 préparations : Ce kit vous permet de purifier l'ADN génomique du sang total ou de la couche leucocytaire de manière automatisée et à moindre coût. Pour utiliser ce kit, vous aurez besoin de l'instrument MPure-12™ Système automatisé de purification des acides nucléiques.

3. Kit d'isolation d'ADN GNOME® : Ce kit est conçu pour isoler l'ADN génomique de poids moléculaire élevé à partir des cellules sanguines, des globules blancs nucléés et d'autres cellules et tissus de mammifères.

Vous pouvez choisir le kit qui convient le mieux à vos besoins en fonction de la nature de vos échantillons et de la quantité d'ADN que vous souhaitez isoler. Ces kits vous offrent une gamme d'options pour faciliter et optimiser le processus d'isolement de l'ADN à partir du sang.